شناسایی مولکولی پپتیدتوکسین  از غده  زهری عقرب 09198000513

جداسازی و خالص سازی فراکسیون های سمی زهر عقرب مزوبوتوس اپیوس

عقرب مزوبوتوس اپیوس از عقرب های خانواده بوتیده بومی ایران به ویژه در منطقه خوزستان می باشد. زهر عقرب ها به ویژه عقرب های خانواده بوتیده از ترکیبات فعال بیولوژیکی مختلف از جمله انواع توکسین ها تشکیل شده است. این توکسین ها انواع مختلفی از کانال های یونی بدن حشرات و یا پستانداران را تحت تاثیر قرار می دهند. جهت مطالعه اجزای سمی در زهر عقرب لازم است ابتدا خالص شوند لذا در این مطالعه فراکسیون های سمی زهر عقرب جداسازی و سمی ترین آن ها خالص شدند.مواد و روش کار: اجزا سمی زهر خام عقرب مزوبوتوس اپیوس به وسیله کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون روی سفادکس G-50 در تعادل با بافراستات آمونیوم 20 میلی مولار pH=4.7 جدا سازی شد. سپس اجزای سمی ترین فراکسیون به وسیله کروماتوگرافی تعویض یونی کاتیونی جدا شد و خلوص آن ها به وسیله الکتروفورز مورد تایید قرار گرفت.بحث و نتیجه گیری: از 816 میلی گرم پروتیین زهر خام که روی ستون سفادکس G-50 برده شد، 815 میلی گرم پروتئین در 6 فراکسیون تفکیک شده به دست آمد. سمیت تمام فراکسیون ها روی موش آزمایش شد و مشاهده شد که فراکسیون های III و IV برای موش ها اثر سمی دارند و LD50 آن ها به ترتیب 0.4و 0.46 میلی گرم بر کیلوگرم به دست آمد. فراکسیون III به علت داشتن LD50 پایین روی ستون CM-Sephadex C-25 در تعادل با بافراستات آمونیوم 20 میلی مولار و pH =4.7 برده شد. در این مرحله فراکسیون سوم به 20 زیر فراکسیون تفکیک شد. که با بررسی سمیت آن ها بر روی موش ها مشخص گردید که زیر فراکسیون های III.14 تا III.19 دارای اثر سمی بودند. از 250 میلی گرم پروتئین فراکسیون III که روی ستون برده شد، 242.75 میلی گرم (97%) در زیر فراکسیون های تفکیک شده به دست آمد. زیر فراکسیون III.14 دوباره بر روی ستون Sephadex C-25-CM در تعادل با بافراستات آمونیوم 20 میلی مولار و pH =6 به کاربرده شد. در این مرحله سه توکسین به صورت خالص به دست آمد. توکسین III.14.4 با LD50برابر با 0.11 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن موش، بیشترین سمیت را دارا بود. در این مطالعه سه توکسین به طور خالص جدا شد که در تحقیقات بعدی می توان از آنها در تهیه آنتی سرم و یا مطالعه خصوصیات ساختمانی و اثرات فیزیولوژی فارماکولوژی استفاده نمود.

شناسایی مولکولی پپتیدتوکسین MeBTX از غدد زهری عقرب مزوبوتوس اپئوس ایران

 پلی‌پپتید‌های زهر عقرب علاوه بر عملکرد روی کانال‌های یونی، در فعالیت‌های ضد میکروبی نیز نقش دارند.  در این مطالعه یک پپتید توکسین از زهر یکی از فراوان‌ترین عقرب‌های بومی ایران به نام مزوبوتوس اپئوس (Mesobuthus eupeus) تکثیر و توالی نوکلئوتیدی آن مورد شناسایی ملکولی قرار گردید.  پس از شناسایی عقرب، مجموع کل RNA از غده زهر آن استخراج و غلظت آن با دستگاه اسپکتروفوتومتر اندازه‌گیری شد.  سپس به منظور ساخت cDNA، از کل RNA به عنوان رونوشت و از الیگو (dT) اصلاح شده به عنوان آغازگر استفاده گردید.  در ادامه، با استفاده از تکنیک RT-PCR پس از بهینه‌سازی شرایط PCR، یک قطعه cDNA تکثیر گردید.  با استفاده از برنامه آنالیز پپتید راهنما مشخص شد که این پلی‌پپتید کد شده توسط این cDNA دارای یک پپتید راهنما می‌باشد که اسید آمینه گلایسین در وضعیت بیستمین اسید آمینه به عنوان شروع پلی‌پپتید بالغ محسوب می‌گردد.  همترازی این پلی‌پپتید با توالی‌های مشابه در بانک ژن NCBI نشان داد که این ژن به میزان 96، 94 و 67 درصد با نروتوکسین‌های طویل از عقرب‌های martensii, M.، Buthus occitanus Israelis و Tityus costatus به ترتیب، شباهت دارد.  مقایسه این cDNA با ژن‌های مشابه از دیگر گونه‌های عقرب نشان داد که این ژن در ناحیه بین اسید آمینه 85-55 حاوی یک دومین بنام "Arthropod defensin" است.  این دومین که غنی از سیستئین می‌باشد به خانواده‌ای از پپتید‌های ضد باکتریایی که عمدتاً روی میکروب‌های گرم مثبت مؤثرند، متعلق است.  وجود تشابه بالا به همراه وجود 6 سیستئین محافظت شده و همچنین نتایچ فیلوژنی همگی دلالت بر این دارد که این ژن احتمالاً یک عضو جدید از خانواده پپتید توکسین‌ها از عقرب مزوبوتوس اپئوس ایران است که در مقایسه با توالی‌های مشابه از منشاء مشترکی سرچشمه گرفته‌اند.

خطرناک‌ترین کژدم

برخلاف شایعه‌ای که می‌گوید خطرناک بودن عقرب به رنگ آن بستگی دارد و در برخی از نقاط ایران معتقدند که عقرب زرد خطرناک است و در برخی از نقاط دیگر عقرب سیاه را خطرناک می‌دانند، این ارزیابی قابل قبول نیست و رنگ عقرب هیچ نقشی در غلظت سم یا خطرناک بودن آن ندارد. می‌توان گفت که سم عقرب‌های نواحی خشک و گرمسیر در ایران دارای غلظت بالایی است. خوشبختانه خطرناک‌ترین عقرب‌ها هم هنگام گزش انسان معمولاً تمامی سم خود را تزریق نمی‌کنند زیرا عقرب در مصرف سم صرفه‌جویی می‌کند و همیشه در گزش اول با تزریق مختصری آنزیم سعی در دور کردن دشمن دارد، ولی چنانچه اسیر شود و راه فراری نداشته باشد مجبور به تزریق سم اصلی خود می‌شود. عقرب برای جایگزینی سم خود نیاز به تغذیه بیشتر دارد و برای همین زیاد مایل نیست که سم خود را هدر دهد. سم نوعی کژدم به نام سنتروروئید اسکالپچراتوس (Centruroides Sculpturatus) شدیداً کشنده‌است که عقربی کوچک و زرد رنگ است با یک توبرکول کوچک روی پشت. طول این جانور ۲/۵ تا ۷/۵ سانتی متر است و به آن «عقرب جرار» نیز گفته می‌شود. خطرناک ترین نوع عقرب در ایران عقرب گاردیوم است که در منطقه خوزستان یافت می شود و سمی کشنده دارد سم سایر عقربها کشنده نیست. سم زهر کژدم مایعی بی‌رنگ و شفاف است که خاصیت قلیایی تا خنثی دارد و در واقع نوعی پروتئین است. سم از عناصری مانند کربن، ئیدروژن، ازت و گوگرد تشکیل شده‌است. سم شامل پروتئین‌های مختلفی از قبیل توکسین و آنزیم می‌شود. توکسین‌ها یا فاکتورهای سمی شامل نورووکسین (سم عصب‌گرا)، هموتوکسین و کاردیوتوکسین است.

فعالیت آنزیم فسفولیپاز A2 و هیالورونیداز در زهر عقرب مزوبوتوس اپیوس اپیوس

سابقه و هدف: عقرب مزوبوتوس اپیوس متعلق به خانواده بوتیده می‌باشد. این عقرب یکی از فراوان‌ترین عقرب‌ها در ناحیه خوزستان است و مسوول حدود 45% عقرب‌زدگی‌ها در این ناحیه است. زهر عقرب‌ها از نوروتوکسین‌هایی تشکیل شده که کانال‌های یونی سلول‌ها را تحت تاثیر قرار می‌دهند. با توجه به اهمیت مطالعه روی عقرب‌ها در این ناحیه جغرافیایی و اینکه کار زیادی در ارتباط با فعالیت آنزیم‌ها در زهر عقرب مزوبوتوس اپیوس اپیوس انجام نشده بود بر آن شدیم تا فراکسیون‌های زهر عقرب مزوبوتوس اپیوس را توسط کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون جدا نموده و فعالیت آنزیم‌های فسفولیپاز A2 و هیالورونیداز را در فراکسیون‌های جدا شده بررسی نماییم.

مواد و روش‌ها: یک گرم زهر خام در 10 میلی‌لیتر آب حل گردید و در xg 18000 به مدت 12 دقیقه سانتریفوژ گردید. محلول رویی که حاوی پروتئین بود در ستون کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون حاوی سفادکس G50 در تعادل با بافر استات آمونیوم 20 میلی‌مولار PH 4.7 با سرعت 30 میلی‌لیتر در ساعت به کار برده شد. محلول خروجی در حجم‌های 3 میلی‌لیتر جمع‌آوری شد. جذب نوری به طور مداوم در طول موج 280 نانومتر اندازه‌گیری گردید. سپس مقدار پروتئین، فعالیت آنزیم فسفولیپاز A2 و هیالورونیداز در تمام فراکسیون‌های جدا شده اندازه‌گیری شد.

نتایج: یک گرم زهر خام حاوی 816 میلی‌گرم پروتئین بود. فعالیت آنزیم در زهر خام، فراکسیون I و به مقدار جزیی در فراکسیون II مشاهده شد و به ترتیب دارای 12/53، 3/76 و 43/2% فعالیت همولیزی می‌باشند. فعالیت مخصوص آنزیم به ترتیب 32/590، 1090 و 37/30 می‌باشد. فعالیت هیالورونیداز در زهر خام و تنها در فراکسیون اول مشاهده شد. فعالیت مخصوص آنزیم هیالورونیداز در زهر خام TRU/mg 740 و در فراکسیون I حاصل از کروماتوگرافی TRU/mg 5/4574 به دست آمد و درجه خلوص آنزیم 18/6 تعیین شد.

نتیجه‌گیری: زهر عقرب مزوبوتوس اپیوس اپیوس دارای هر دو فعالیت فسفولیپازی و هیالورونیدازی می‌باشد که با استفاده از کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون در فراکسیون اول جدا می‌شود.